←back

Saadud ülesandeks oli esitada moodus uuritava antibiootikumi toimeainesisalduse välja selgitamiseks võrreldes kvantitatiivselt uuritava antibiootikumi ja kindlaks määratud toimeainesisaldusega referents-antibiootikumi võimet bakteriaalset kasvu pärssida (edaspidi lihtsalt "kolistiini sisalduse määramine"). Teie saadetud European Pharmacopoeia 5.0 "2.7.2 Microbiological assay of antibiotics" etalon-antibiootikumide nimekirjas on üksnes kolistiinsulfaadi mitteaktiivne 1 derivaat colistimethate sodium (CMS), mille hüdrolüüsil tekib muuhulgas ka aktiivne ühend kolistiinsulfaat 2 3 4 5 6 7 8 (As a prodrug, colistimethate sodium is readily hydrolyzed to form partially sulfomethylated derivatives, as well as colistin sulfate, the active form of the drug. 1) Lähtuksin European Pharmacopoeia 8.0 9 (uusim mulle kättesaadav versioon; edaspidi lihtsalt "farmakopöa") samanimelisest peatükist, kus on välja toodud ka kolistiinsulfaat.

Farmakopöa esimene meetod (2.7.2.-A) põhineb antibiootikumi difusioonil agaril (agardifusiooni meetod). Kolistiini difusioon agaril arvatakse olevat laengu ja suure molekulaarmassi tõttu häiritud 10 11 12, mis võib takistada bakteri kasvuvaba tsooni diameetri ja antibiootikumi MIC (minimum inhibitory concentration)vahelise usaldusväärse seose leidmist 13 kolistiinile mõõdukalt resistentsete tüvede puhul 14 15 16. Just resistentsete tüvede ebausaldusväärse määramise tõttu keelas EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) hiljuti Kirby-Bauer diskdifusiooni protseduuri kolistiinile tundlikkuse välja selgitamiseks kasutada. 17 Sellegipoolest on meetod laialdaselt kasutust leidnud 18 19 20 21 22 23 ja kolistiini sisalduse määramiseks on agardifusiooni viisi edukalt kasutatud agarisse tehtud õõnsuste 24 25 26 meetodil.

Farmakopöa teine meetod (2.7.2.-B) põhineb kasvusöötme läbipaistvuse mõõtmisel (turbidimetric method). Söötme hägustumine pidurdub lisatud erinevatel kontsentratsioonidel antibiootikumi põhjustatud bakteriaalse kasvu häirituse tõttu. Kirjandus turbidimetric viisile kolistiini sisalduse määramisel ei viita (broth micro/macro-dilution viis põhineb ka kasvusöötme läbipaistvuse määramisel ja seda kasutatakse kolistiinisulfaadi MIC leidmiseks, aga mitte kolistiini sisalduse määramiseks), mis võib olla tingitud kolistiini amfipaatsest 27 ja polükatioonsest 15 olemusest põhjustatud mittespetsiifilisest 27 kleepuvusest näiteks klaasile, plastmassile ja sterilisatsioonifiltritele 28 kusjuures kleepuvus sõltub kolistiini kontsentratsioonist ja on küllastuva iseloomuga. 7 27 Kleepjate omaduste tõttu võib kolistiin madalatel kontsentratsioonidel 24 h jooksul üle 90 % ulatuses laborinõudele ja -tarvikutele nakkuda 29 ja seeläbi kolistiini kontsentratsioon lahuses oluliselt väheneda 14.

Kuna agardifusiooni meetodi kordustäpsus (täpsemalt korratavus ehk reproducibility) oli immutatud paberdiske kasutades 15 andmetel kehvavõitu ja turbidimetric meetodi puhul täheldas 30 kolistiini kontsentratsiooni suurt varieeruvust ka identsete katseanumate lõikes ning 31 madalat tundlikkust (sensitivity), kasutaksin farmakopöas välja toodud referentstüve E. coli ATCC 10536 põhjal 9 "Coli-2400" kolistiinsulfaadi sisalduse määramiseks agardifusiooni viisi agarisse tehtud õõnsuste või agarile asetatud vormide meetodil. Seda arvamust toetab nii USA farmakopöa 32, soovitades kolistiinsulfaadi sisalduse määramisel kasutada agardifusiooni viisi agarile asetatud vormide meetodil, kui ka uuritud kirjandus, kus on agardifusiooni meetod kolistiini uurides laialdaselt kasutust leidnud 3 (current recommendations for the microbiological assay of "colistin" involve diffusion methods that use long periods of incubation at elevated temperatures (up to 24 h at 37°C) 3 18 19 20 21 22 23 24 25 26. Kuigi patogeenide kolistiinile tundlikkuse määramiseks agardifusiooni viis ei sobi 17, oleksid antibiootikumi(de) võrdlemisel (meie kontekstis võrdleksime referents-kolistiinsulfaati "Coli-2400"-ga) farmakodünaamikat mõjutavad eripärad raskendatud difusiooni näol ühesugused 33 nii test- kui ka kontrollgrupi jaoks ning minu hinnangul tõenäoliselt nulliksid üksteist.

Tuntud kitsaskohti silmas pidades võiks meetodi rakendamisel vältida kolistiini kokkupuudet polüstüreenist laboritarvikutega (sh Petri tassid); minimeerida lahjenduste arvu ja valmistada kolistiini lahused vahetult enne kasutamist. 30 34 Petri tassi põhja mitte ulatuvate identsete õõnsuste tegemine söötmesse võib olla problemaatiline, mistõttu eelistaksin roostevabast terasest vorme, mille sisse saab tilgutada erineva kontsentratsiooniga kolistiinsulfaadi lahused. Kirjanduses puudub info kolistiini kleepumisest metallide külge, kuid 35 leidis roostevaba terase kolistiini kromatograafiaks sobiliku kolonni materiali olevat. Siiski eelistaksin katsetel kolistiinsulfaadi suuremaid kontsentratsioone, vältimaks kolistiini märkimisväärse osakaalu võimalikku naket 7 roostevabast terasest vormide, pipetiotsikute ja teiste laboritarvikutega.

Meetodi sobilikkuse määrab paljuski saadud tulemuste analüüs lineaarsuse, mõõtetäpsuse (accuracy), kordustäpsuse (precision), mõõteulatuse (range) ja mõjutuskindluse (kapriissus, robustness) suhtes. 36, kemterm

1.       Lineaarsust hindaksin vähemalt kolme geomeetrilises progressioonis lahjenduse logaritmilise kolistiini sisalduse ja vastava kasvuvaba tsooni diameetri vahelise seose regressioonanalüüsiga, seda nii referents- kui ka uuritava ("Coli-2400") kolistiinsulfaadiga. 37

2.       Kordustäpsus (precision)

2.1.    Korratavuse (repeatability) leidmiseks määraksin nii referents- kui ka uuritava kolistiinsulfaadi põhjustatud kasvuvaba tsooni diameetri vähemalt kolmel kolistiini kontsentratsioonil kolmes korduses ja leiaksin suhtelise standardhälbe (relative standard deviation). 36

2.2.    Intermediate precision leidmiseks sooritaksin korratavuse mõõtmised kolmel järjestikusel päeval ja leiaksin suhtelise standardhälbe. 36

3.       Mõõtetäpsuse (accuracy) määramiseks võrdleksin referents-kolistiinsulfaadi kolme mediaani geomeetrilises progressioonis kontsentratsiooni kalibratsioonikurve 20 % vähem ja 20 % rohkem referents-kolistiinsulfaati sisaldavate kalibratsioonikurvidega. 37 38

4.       Mõõteulatuse (range) arvutaksin eelmainitud analüütiliste protseduuride tulemuste alusel: "Coli-2400" kolistiinsulfaadi kontsentratsioon peab olema referents-kolistiinsulfaadist maksimaalselt ±20 % varieeruv. 36

5.       Mõjutuskindlust (robustness) võib hinnata näiteks inkubeerimisaega, –temperatuuri, puhvri pH-d või inokuleeritud söötme tihedust mõõdukalt muutes. 37 39 Kuna mõjutuskindluse määramine pole meetodi valideerimisel esmatähtis 36, jätaksin selle esialgu hindamata.

 

Kuna kirjanduses varieerub kolistiinsulfaadi kontsentratsioon kolistiini sisalduse määramise uuringutes 10 IU/ml kuni 32 000 IU/ml 24 25 26 (kui 1 mg = 20500 IU 40), alustaksin uuringut väikesemahulise ökonoomse katsega, kus selgitaksin "Coli-2400" baasil välja umbkaudse kolistiinsulfaadi kontsentratsiooni vahemiku, mis annab selgelt eristatavad inhibitsioonitsoonide diameetrid ja lineaarse graafiku.

Uuringute läbiviimiseks on farmakopöas soovitatud "Medium B", mis sisaldab polüsorbaat 80, mis arvatakse vähendavat kolistiini kleepuvust pindadele.9 Uusimate andmete 29 kohaselt võib kolistiini ja polüsorbaat 80 vaheline sünergismi teke katsetulemuste varieeruvust hoopis suurendada, mistõttu on viimase kasutamine muutunud taunitavaks.45 Arvestades, et farmakopöa 9 jätab söötme valikul mänguruumi, kasutaksin olenevalt komponentide kättesaadavusest kas laialt levinud ja ka kolistiinsulfaadi sisalduse määramisel kasutatud 7 14 15 Mueller–Hinton söödet või ilma polüsorbaat 80 farmakopöas 9 esitletud "Medium B" söödet, mille inokuleeriksin 0.5 McFarland 11 41 tiheduse saavutamiseks 16-18 tundi 37 ℃ kasvanud E.coli ATC 10536 söötmetassilt steriilse veega maha pestud settega. 9 (sette ja supernatandi eraldamiseks tsentrifuugiksin segu; 44 ei täheldanud 22505 × g tsentrifugaaljõul E. coli rakkude surma) 48-50 ℃ temperatuuril inokuleeritud "Medium A" valaksin 20 ml kaupa Petri tassidesse, saavutamaks 2–5 mm paksuse söötmekihi. 9

Peale söötme tahenemist asetaksin igale tassile sümmeetriliselt 6 roostevabast terasest ümarat õõnest põhjata 3–4 mm diameetriga 42 vormi ja iga vormi sisse tilgutaksin 50 μl 43 uuritava kontsentratsiooniga kolistiinsulfaadi lahust.

Oletame, et esialgse lineaarse seose inhibitsioonitsoonide diameetritega sain "Coli-2400" kontsentratsioonidel 10 000, 20 000 ja 40 000 IU/ml. 32

Lineaarsuse ja kordustäpsuse (precision) leidmiseks paigutaksin inokuleeritud söötmetassile 6 vormi sisse mainitud kontsentratsioonidel nii referents-kolistiinsulfaadi (R1, R2 ja R3 vastavalt 10 000, 20 000 ja 40 000 IU/ml) kui ka "Coli-2400" 50 μl lahused (T1, T2 ja T3 vastavalt 10 000, 20 000 ja 40 000 IU/ml), seda kolmes korduses (3 söötmetassi) ja kolmel järjestikusel päeval (∑=9 söötmetassi). Referents- ja uuritava kolistiinsulfaadi lahused paigutaksin tassile üle ühe, jälgides, et kõrvuti ei satuks kangeima kontsentratsiooniga segud. 9

Mõõtetäpsuse (accuracy) leidmiseks paigutaksin inokuleeritud söötmetassile 6 vormi sisse mainitud kontsentratsioonidel referents-kolistiinsulfaadi 80 %, 100 % ja 120 % lahused (R1–3=80, R1–3=100, R1–3=120stratified randomized kujul neljas korduses (∑=6 söötmetassi).

Vastavalt farmakopöale hoiaksin söötmetasse enne 37 ℃ inkubeerimist 4 h 4 ℃, andmaks kolistiinile rohkem aega agaris difundeeruda, enne kui bakterite suur arvukus söötme "ära ummistab". 11 42 Peale inkubeerimist mõõdaksin vähemalt 0,1 mm täpsusega kõikide inhibitsioonitsoonide diameetrid. 9

Ülaltoodud tulemuste analüüsi metoodika on kooskõlas European Pharmacopoeia 8.0 peatükiga "2.7.2 Microbiological assay of antibiotics". Eeldan, et minu kasutada on 90 või 100 mm diameetriga Petri tassid.

Kokkuvõtteks, kolistiini sisalduse määramiseks leian parima olevat agarile asetatud vormidega agardifusiooni meetodi, sest teised viisid on enam häiritud halva difusiooni ja pindadele nakkumisega seotud probleemidest ning identsete õõnsuste tegemine agarisse võib olla liiga keeruline. Eeldan, et kitsaskohad nullivad üksteist, tagades katsetingimuste samasuse nii referents- kui ka uuritava katsegrupi jaoks.

Kasutatud kirjandus

 

1.

L. M. Lim et al. 2010. Resurgence of Colistin: A Review of Resistance, Toxicity, Pharmacodynamics, and Dosing.

2.

Leong et al. 2010. Hypersensitivity pneumonitis due to high-dose colistin aerosol.

3.

P. J. Bergen et al. 2006. Colistin Methanesulfonate Is an Inactive Prodrug of Colistin against Pseudomonas aeruginosa.

4.

L. Dalfino, N. Brienza. 2012. Reply to Drs Ahern and Schnoor (in Clinical Infectious Diseases 55:9).

5.

Global Antibiotic Research and Development (GARD) Partnership. 2016. Scientific Consultation – Project Proposals (29.02.16).

6.

Huang et al. 2015. Mucin Binding Reduces Colistin Antimicrobial Activity.

7.

D. Landman et al. 2008. Polymyxins Revisited.

8.

P. P. H. le Brun et al. 2002. Dry powder inhalation of antibiotics in cystic fibrosis therapy: part 2: Inhalation of a novel colistin dry powder formulation: a feasibility study in healthy volunteers and patients.

9.

European Pharmacopoeia 8.0.

10.

J. Turnidge et al. (CLSI-EUCAST) 2013. In Vitro Susceptibility Testing, What are the Critical Issues?

11.

V. Balaji et al. 2011. Polymyxins: Antimicrobial susceptibility concerns and therapeutic options.

12.

Z. Kassamali et al. 2013. Polymyxins: wisdom does not always come with age.

13.

M. Hogardt et al. 2004. Pitfalls of polymyxin antimicrobial susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients.

14.

M. Albur et al. 2013. Colistin susceptibility testing: time for a review.

15.

J. R. Lo-Ten-Foe et al 2007. Comparative evaluation of the VITEK 2, disk diffusion, etest, broth microdilution, and agar dilution susceptibility testing methods for colistin in clinical isolates, including heteroresistant Enterobacter cloacae and Acinetobacter baumannii strains.

16.

British Society for Antimicrobial Chemotherapy. 2013. Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing.

17.

European Committee On Antimicrobial Susceptibility Testing. 2017. EUCAST warnings concerning antimicrobial susceptibility testing products or procedures.

18.

A. K. Ilkem et al. 2017. Evaluation of the synergistic effect of a combination of colistin and tigecycline against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.

19.

C. E. Tsai, F. Kondo. 2001. Improved agar diffusion method for detecting residual antimicrobial agents.

20.

R. H. ElSherif et al. 2015. Polymyxins: Re-considering the Disk Diffusion Susceptibility Testing Method in MALDI–TOF-identified Gram Negative Bacilli.

21.

C. Stein et al. 2015. Three Dimensional Checkerboard Synergy Analysis of Colistin, Meropenem, Tigecycline against Multidrug-Resistant Clinical Klebsiella pneumonia Isolates.

22.

N. Markou et al. 2003. Intravenous colistin in the treatment of sepsis from multiresistant Gram-negative bacilli in critically ill patients.

23.

I. M. van der Heijden et al. 2007. Comparison of disc diffusion, Etest and broth microdilution for testing susceptibility of carbapenem-resistant P. aeruginosa to polymyxins.

24.

O. H. Albadawy et al. 2013. Microbiological assay of colistin sulfate antibiotic in pharmaceutical formulations.

25.

G. Calixto et al. 2014. Microbiological Assay for the Determination of Colistin Sulphate.

26.

M. Wootton et al. 2005. Development of a novel assay method for colistin sulphomethate.

27.

P. J. Bergen et al. 2012. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of ‘old’ polymyxins: what is new?

28.

F. Marinelli & O. Genilloud. 2014. Antimicrobials: New and Old Molecules in the Fight Against Multi-resistant Bacteria.

29.

R. Humphries. 2017. Colistin testing – Are we whacked out?

30.

M. Karvanen et al. 2017. Colistin Is Extensively Lost during Standard In Vitro Experimental Conditions.

31.

L. Poirel et al. 2017. Polymyxins: Antibacterial Activity, Susceptibility Testing, and Resistance Mechanisms Encoded by Plasmids or Chromosomes.

32.

The United States Pharmacopeia 35. 2012.

33.

E. Vandeplassche et al. 2017. Developing selective media for quantification of multispecies biofilms following antibiotic treatment.

34.

J. Li et al. 2003. Stability of Colistin and Colistin Methanesulfonate in Aqueous Media and Plasma as Determined by High-Performance Liquid Chromatography.

35.

T. Koch & C. O. Petersen. 2012. Method for purification of colistin and purified colistin components.

36.

European Medicines Agency. 1995. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.

37.

P. V. Alessio & H. R. N. Salgado. 2012. Development and Validation of a Successful Microbiological Agar Assay for Determination of Ceftriaxone Sodium in Powder for Injectable Solution.

38.

A. F. Zuluaga et al. 2009. Application of microbiological assay to determine pharmaceutical equivalence of generic intravenous antibiotics.

39.

C. S. Paim et al. 2011. Gemifloxacin mesylate (GFM) stability evaluation applying a validated bioassay method and in vitro cytotoxic study.

40.

Residue Evaluation of Certain Veterinary Drugs: Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Meeting, Food and Agriculture Organization of the United Nations 2006.

41.

W. Lorowitz et al. 2005. Integrating Statistics with a Microbiology Laboratory Activity.

42.

M. Lalpuria et al. 2013. Modified agar diffusion bioassay for better quantification of Nisaplin.

43.

J. V. Bennett et al. 1966. Simplified, Accurate Method for Antibiotic Assay of Clinical Specimens.

44.

S. Deguchi et al. 2011. Microbial growth at hyperaccelerations up to 403,627 × g.

45.

The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and Clinical and Laboratory Standards Institute. 2016. Recommendations for MIC determination of colistin as recommended by the joint CLSI-EUCAST Polymyxin Breakpoints Working Group.

 

←back